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阿奇霉素片含量的HPLC法测定

作者:www.jiaoshilw.com 更新时间:2018/10/12 13:11:13

阿奇霉素(azithromycin)是第一個十五元环大环内酯类抗生素,也是第一个氮杂内酯类抗生素,相比红霉素,其最大的特点是对酸稳定。本品临床给药次数少,疗程短,被认为是一个很有效的大环内酯类抗生素,临床应用广泛,尤其适合于混合感染的治疗[1]。其制剂阿奇霉素片被列为国家基本药物,具有广泛的市场。本公司为了提高产品质量,对其处方及工艺进行了改进。为了保证分析检测结果准确、可靠,可有效地控制药品的内在质量,必须对所采用的分析方法进行验证。依据《中国药典》药品质量标准分析方法验证指导原则及《药品GMP指南》要求[2-3],本研究对阿奇霉素片含量测定的HPLC法进行验证,并对每个验证参数设立了可接受标准。通过方法验证,确定该方法可以在本实验室用于阿奇霉素片含量的定量分析,确保检验结果的准确性。 
  1 材料与方法 
  1.1 仪器与试剂 
  Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司);XS205电子分析天平(瑞士Mettler公司);DL-800B智能超声清洗器(上海之信仪器有限公司);L600型台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);阿奇霉素对照品(批号:130593-201301,含量:94.4%,中国食品药品检定研究院);阿奇霉素原料药(批号:AIF-1609001,含量:94.34%,上海现代制药股份有限公司海门基地);磷酸氢二钾、1-辛烷磺酸钠、磷酸二氢铵(HPLC纯,Alfa Aesar公司);甲醇、乙腈(HPLC纯,美国默克公司);磷酸(HPLC纯,美国TEDIA公司);氨水(分析纯,上海凌峰化学试剂有限公司)。 
  1.2 方法 
  1.2.1 溶液配制 
  1)稀释液 磷酸二氢铵溶液(称取磷酸二氢铵1.73 g,加水1 000 ml溶解,用氨水调节pH至10.0±0.05)-甲醇-乙腈(7∶7∶6)。 
  2)对照品溶液 精密称取阿奇霉素对照品约26.2 mg,置于100 ml量瓶中,加稀释液适量使其溶解,再用稀释液定容,摇匀,作为对照品溶液。 
  3)供试品溶液 取本品20片,研磨成细粉,精密称取细粉约92 mg(约含阿奇霉素50 mg),置200 ml量瓶中,加入稀释液约150 ml,超声15 min,冷却至室温后加入稀释液定容,摇匀。取溶液适量,以6 000 r/min离心10 min,取上清液作为供试品溶液。 4)空白全辅料溶液 精密称取空白全辅料约39.6 mg,置200 ml量瓶中,余同供试品溶液操作,取上清液作为空白全辅料溶液。 
  5)线性测试溶液 精密称取阿奇霉素对照品约26.2 mg,置于50 ml量瓶中,加稀释液适量使其溶解,再用稀释液定容,摇匀,作为对照品贮备液。分别精密量取该溶液3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 ml置10 ml量瓶中,用稀释液稀释至刻度,摇匀,作为不同浓度的线性测试溶液。 
  6)回收率测试溶液 精密称取空白全辅料3份各39.6 mg,分别与阿奇霉素41.9、52.4、62.9 mg一起置于3個200 ml量瓶中,余同供试品溶液操作,配制成80%、100%和120%的回收率测试溶液各3份。 
  1.2.2 色谱条件 
  色谱柱为Waters XBridge C18柱(4.6 mm×75 mm,5μm),流动相为磷酸盐缓冲液(4.4 g磷酸氢二钾和0.5 g 1-辛烷磺酸钠溶解于1 000 ml水中,用磷酸调节pH至8.2)-甲醇-乙腈(8∶3∶9),检测波长210 nm,流速1.5 ml/min,柱温50 ℃,进样体积50 ml,进样时间:15 min。 
  2 结果 
  2.1 专属性试验 
  分别精密吸取空白溶剂(稀释液)、空白全辅料溶液、对照品溶液各50 ml,注入液相色谱仪,记录色谱图。结果表明空白溶剂(稀释液)、空白全辅料溶液在阿奇霉素峰位置无杂质峰(图1中保留时间6.506 min),对阿奇霉素含量测定无干扰。  
  2.2 系统适用性试验 
  5次连续进样测定的主峰面积RSD为0.49%(应≤1.5%),对照品溶液主峰理论板数为4 574(应≥1 000),拖尾因子为1.42(应≤2.0)(表1)。结果表明系统重复性良好,系统适用性符合规定。  
  2.3 线性关系试验 
  以线性溶液浓度C为横坐标、阿奇霉素峰面积A为纵坐标进行线性回归,得回归方程A=3 220 442C+844,r=0.999 99,表明该方法在149.47~348.77 mg/ml浓度范围内,线性关系良好(表2)。  
  2.4 准确度试验(含量测定中加样回收率的检测) 
  取3种不同浓度的回收率测试溶液分别进样测试,每个浓度样品进行3次平行测试。回收率按外标法以峰面积的平均值计算。结果表明,平均回收率为100.7%(应为98.0%~102.0%),RSD为0.68%(应≤2.0%),均符合规定(表3)。  
  2.5 重复性试验 
  取阿奇霉素片171107批,按含量测定方法,配制6份供试品溶液进行检测,6份平行样的含量分别为100.98%、100.78%、99.34%、99.69%、99.84%、99.41%,平均含量为100.01%,RSD为0.71%(应≤2.0%),符合规定。 
  2.6 中间精密度试验 
  取阿奇霉素片171107批,由不同人在不同日期及不同仪器按含量测定方法进行检测,即2人各做3份,6次数据分别为99.69%、99.84%、99.41%、98.88%、98.19%、98.96%,平均含量为99.16%,RSD为0.62%(应≤2.0%),符合规定。 
  2.7 溶液的稳定性试验 
  对照品溶液和供试品溶液于室温放置0、4、8、12、16、20、24 h时分别进样测试,结果表明:对照品溶液和供试品溶液于室温下放置20 h内稳定,其主峰面积的RSD分别为0.50%,0.88%(应≤1.5%),符合规定。 
  2.8 耐用性 
  平行制备供试品溶液2份,每份进样2次,分别考察预定不同的有机相比例的流动相(①甲醇比例不动,盐相和乙腈比例±5%;②盐相比例不动,甲醇和乙腈比例±5%)、波长±2 nm、柱温±5 ℃、流速±0.2 ml/min条件下的系统适用性及含量。实验结果表明各条件波动范围内,对照品溶液主峰的理论板数均≥1 000、拖尾因子均≤2.0,符合要求;各条件下含量(n=6)的RSD均<1.5%(应≤1.5%)。试验结果表明,本方法的耐用性良好。 
  2.9 样品检测 
  取三批阿奇霉素片,按本法进行含量检测,结果分别为100.88%、98.92%、98.89%(应为90.0%~110.0%),均符合规定。 
  3 讨论 
  《中国药典》2005年版采用抗生素微生物检定法进行阿奇霉素的含量分析,尽管该法能真实体现该药品的抗菌活性,但检验周期较长、操作较繁琐。而HPLC法专属性强,灵敏度高,准确度和重复性好,省时方便,是阿奇霉素含量测定的有效手段[4-5]。 
  《中国药典》2015年版的含量检测方法[6],需要进系统适用性溶液,且应与标准系统适用性图谱一致,故使用250 mm长柱,主峰出峰时间约为30 min,流动相配制过程对pH的要求较高。 
  潘强[4]、韩正爽等[5]的含量测定方法选用250 mm长柱,流动相组分中无甲醇,流速较低,以致检测时间延长,工作效率偏低。 
  本研究建立的方法参照美国药典方法[7-8],选用75 mm长的短柱,使得主峰出峰时间提早到6~7 min,考虑空白辅料的影响,每针检测时间只需15 min,大大缩短检测时间,提高工作效率;且不需使用系统适用性对照品,系统适用性试验阿奇霉素对照品溶液主峰理论板数(应≥1 000),拖尾因子(应≤2.0)符合规定即可。含量测定的色谱条件与溶出度的一致,使得检验过程更加便捷。故该方法简便、快速,能有效地降低分析成本,减小实验室污染。并且本法用离心的方法获得供试品溶液,杜绝了使用过滤器带来的不利影响。同时,在检测中减少了不必要的稀释步骤,严格控制实验条件,在湿度符合要求的情况下,称量过程中由一人操作,避免多人操作带来的人为误差。因标准溶液的配制过程对阿奇霉素含量测定准确度的影响较大[9],故本法可以通过加大对照品称样量,来减少不确定度对结果的影响,从而更好地控制药物分析的测量结果。 
  参考文献 
  [1] 商鼎. 阿奇霉素片的溶出度研究[J]. 上海医药, 2017, 38(13): 63-66. 
  [2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(2015年版)四部[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2015: 374-377. 
  [3] 国家食品药品监督管理局药品认证管理中心. 药品GMP指南: 质量控制实验室与物料系统[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2011: 129-143. 
  [4] 潘强. HPLC法测定阿奇霉素片的含量[J]. 中国药品标准, 2009, 10(4): 301-303. 
  [5] 韩振爽, 李玮玮. 高效液相色谱法测定阿奇霉素片中阿奇霉素含量[J]. 天津药学, 2013, 25(1): 15-16. 
  [6] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 (2015年版) 二部[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2015: 561-561. 
  [7] The United States Pharmacopeia Convention. Azithromycin tablets[EB/OL]. [2018-03-22]. http://www.drugfuture.com/ Pharmacopoeia/usp36/PDF/1264-1266.pdf. 
  [8] The United States Pharmacopeia Convention. Azithromycin tablets[EB/OL]. [2018-03-22]. http:// www.drugfuture.com/Pharmacopoeia/USP40/download. aspx?filename=850Azithromycin%20Tablets. 
  [9] 张竹. 高效液相色谱法测定阿奇霉素片含量的不确定度分析[J]. 中国药物经济学, 2016, 11(12): 22-25.