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乳没活络散的质量控制及稳定性研究

作者:www.jiaoshilw.com 更新时间:2018/10/12 13:28:37

乳沒活络散源于贵州省土家族民族处方,由三七、没药、乳香和制川乌等十味中药制成的散剂,具有活血化瘀、舒经活络、消肿止痛,促进骨折愈合功能,用于气滞血瘀型骨折、肿胀、瘀斑、肢节活动障碍等疾病,民间药用历史已有两百余年,临床疗效确切。贵州省思南田氏民族传统骨伤医院根据该验方开发了医疗机构制剂(批准文号:黔药制字Z20170134),该制剂已临床使用三十余年,疗效显著,深受患者欢迎。为有效控制乳没活络散的质量,本研究拟以乳没活络散中主药三七的人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1为特征性指标成分,建立乳没活络散的含量测定控制方法,并对乳没活络散的稳定性进行考察。 1 仪器与材料 
  1.1 仪器 ULmate3000高效液相色谱仪(美国Thermo公司),LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津公司);TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂);AE240十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。 
  1.2 材料 乳没活络散(批号:20160113、20160116、20160121、20170708、20170712、20170915,规格:20g/袋);人参皂苷Rg1 对照品(批号:110703-201529)、人参皂苷Rb1对照品(批号:110704-201424)和三七皂苷R1对照品(批号:110745-201318)均购自中国药品生物制品鉴定所;乙腈(色谱纯,天津科密欧化学制剂有限公司),其余试剂均为分析纯。 
  2 方法与结果 
  2.1 溶液制备 
  2.1.1 对照品溶液的制备 分别称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对照品10.67,18.91,21.68mg,置10mL量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制得每1mL含三七皂苷R1 1.067g/L、人参皂苷Rg1 1.891g/L和人参皂苷Rb1 2.168g/L的混合对照品储备液。分别精密吸取混合对照品储备液0.2、0.4、0.8、1.6、2mL分别置5个5mL量瓶中,分别加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,制得三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1系列对照品工作液。 
  2.1.2 供试品溶液及缺三七药材阴性对照液的制备 取乳没活络散供试品1g,精密称定,置索式提取器中,加乙醚50mL,加热回流1h,放冷,弃去乙醚液,药渣挥干,加甲醇50mL,加热回流5h,放冷,提取液蒸至近干,残渣加氨试液10mL使溶解,移置分液漏斗中,用水饱和的正丁醇振摇提取4次,每次20mL,合并正丁醇液,用正丁醇饱和的水20mL洗涤1次,分取正丁醇液,蒸至近干,残渣用适量50 %甲醇溶解,转移至10mL量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。另取按本品制备工艺制备的缺三七药材阴性制剂1g,精密称定,同法制备阴性对照液。 
  2.2 色谱条件及专属性考察 色谱柱:Inertsil ODS-3(4.6×250mm,5μm);流动相:乙腈(A)-水(B)梯度洗脱,洗脱程序(0~12min,19%A;12~32min,19%~30%A;32~40min,30%A;40~54min,30%~38%A;54~60min,38%A);流速:1.0mL/min;柱温45℃;检测波长203nm。在该色谱条件下,各色譜峰与样品中其他组分色谱峰达基线分离,三七皂苷R1理论板数大于79000,如图1所示。 
  2.3 线性关系考察 分别精密吸取上述对照品系列工作液10μL,注入液相色谱仪,记录峰面积,以峰面积Y为纵坐标,进样浓度(mg/L)为横坐标进行线性回归,分别计算线性回归方程,结果见表1。 
  2.4 精密度试验 
  2.4.1 重复性试验 精密称定取本品0.5,1,1.5g,照供试品溶液制备方法制备供试品溶液,精密量取供试品溶液10μL进样测定,并计算平均含量。每个称量做3个平行。在取样为0.5~1.5g时,三七皂苷R1,平均含量为0.1054%,RSD为1.7%(n=9);人参皂苷Rg1平均含量为0.5781%,RSD为1.9%(n=9);人参皂苷Rb1平均含量为0.5234%,RSD为1.4%(n=9)。表明在称量0.5~1.5g范围内该方法重复性良好。 
  2.4.2 中间精密度 以不同的实验人员在不同时间按供试品溶液制备方法分别制备3份供试品溶液并测定。三七皂苷R1平均含量为0.1061%,RSD为1.6%(n=6);人参皂苷Rg1平均含量为0.5788%,RSD为1.8%(n=6);人参皂苷Rb1的平均含量为0.5202%之间,RSD为2.0%(n=6)。测定结果显示表示方法的中间精密度良好。 
  2.5 加样回收率 取已测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和含量的制剂(三七皂苷R1 0.1054%,人参皂苷Rg1 0.5781%,人参皂苷Rb1 0.5234%)0.5g,精密称定,每个称量平行3份,分别按所取样品量中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1质量数的50%、100%和150%的量精密加入对照品,照供试品溶液制备方法制备供试液,测定结果显示三种被测定化合物的回收率在99.78%~101.4%之间,RSD 在1.3 %~2.5%(n=9)之间,说明加样回收率良好。 
  2.6 耐用性试验 为考察所建立的分析方法耐用性,对供试品溶液的稳定性、不同色谱柱温、不同检测波长、不同流速、不同品牌色谱柱、不同品牌的仪器分别进行考察。 
  2.6.1 供试品溶液稳定性考察 取同一供试品,按供试品溶液制备方法制备供试液,分别于0、2、4、8、24h进样,结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1峰面积的RSD分别为0.62%~1.5%(n=5),表明供试品溶液在24h内稳定。 
  2.6.2 不同色谱柱分析结果比较 按拟定的色谱条件,用Inertsil ODS-3(4.6mm×250mm, 5μm)、Phenomonex C18(4.6mm×250mm, 4μm)和伊利特C18(5.0mm×200mm, 5μm)3种色谱柱对同一批号供试品进行测定。三七皂苷R1平均含量为0.1056%,RSD为2.2%(n=6);人参皂苷Rg1平均含量为0.5784%(n=6),RSD为1.5%(n=6);人参皂苷Rb1的平均含量为0.5233%,RSD为1.9%(n=6)。 
  2.6.3 不同流速测定结果比较 以Inertsil ODS-3(4.6mm×250mm, 5μm)色谱柱,以相同的流动相和洗脱梯度条件,分别按0.95、1.00和1.05mL/min不同流速的进行分析。三七皂苷R1平均含量为0.1079%,RSD为2.7%(n=9);人参皂苷Rg1平均含量为0.5790%,RSD为1.0%(n=9);人参皂苷Rb1的平均含量为0.5201%之间,RSD为2.3%(n=9)。结果表明三种流速测试的结果基本一致。 2.6.4 不同柱温测定结果比较 以Inertsil ODS-3(4.6mm×250mm, 5μm)色谱柱,按相同梯度和流速进行洗脱,分别33℃、35℃、和37℃进行分析。三七皂苷R1平均含量为0.1110%,RSD为2.2%(n=9);人参皂苷Rg1平均含量为0.5790,RSD为1.7%(n=9);人参皂苷Rb1的平均含量为0.5264%,RSD为1.0%~2.6%(n=9)。 
  2.6.5 不同检测波长测定结果比较 以Inertsil ODS-3(4.6mm×250mm, 5μm)色谱柱,分别以201nm、203nm和205nm进行检测,其余色谱条件不变进行测定。三七皂苷R1平均含量为0.1107%,RSD为1.7%(n=9);人参皂苷Rg1平均含量为0.5974%,RSD为2.0%(n=9);人参皂苷Rb1的平均含量为0.5285%之间,RSD为2.3%(n=9)。结果表明波长的小幅变动对测定结果基本不影响。 
  2.6.6 不同型号仪器分析结果比较 按拟定的色谱条件,采用Inertsil ODS-3(4.6mm×250mm, 5μm)色谱柱,以Thermo ULmate3000和岛津 LC-20AD高效液相色谱仪对同一批号供试品进行测定,结果三七皂苷R1平均含量为0.1092%,RSD为1.7%(n=6);人参皂苷Rg1平均含量为0.5790%,RSD为1.3%(n=6);人参皂苷Rb1的平均含量为0.5248%,RSD为2.3%(n=6)。 
  2.6.7 制剂中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量测定 取三批次乳没活络散,按照本方法进行样品处理和成分测定,结果见表2。 
  2. 7 乳没活络散稳定性研究 
  2.7.1 加速稳定性考察 取模拟医院制剂包装样品(20160113、20160116和20160121批次),置温度(40±2)℃,相对湿度75%±5%,分别于0、1、2、3、6月取样进行检测。测定结果表明,本品所测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量。试验结果表明,经过6个月加速试验考察,制剂中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量没有明显变化,分别为0.1075%~0.1119%、0.5567%~0.5661%和0.5012%~0.5148%,符合质量标准要求。 
  2.7.2 长期稳定性考察 取模拟医院制剂包装样品,室温贮藏24个月。分别于0、3、6、9、12、18、24月取样进行检测。测定结果表明,本品所测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量。试验结果表明,经室温留样长期试验24个月,制剂中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量没有明显变化,分别为0.1055%~0.1108%、0.5517%~0.5613%和 0.4981%~0.5118%,符合质量标准要求。 
  3 讨论 
  乳没活络散由十味药材组成,直接采用甲醇提取正丁醇萃取方法制备得到的供试品溶液杂质多,干扰严重,被测成分分离度达不到要求,同时,对色谱柱污染严重,因此需要进一步净化样品。根据皂苷类化合物理化性质,先采用乙醚去除制剂中的脂溶性成分,再用甲醇提取制剂三七中皂苷类化合物,将甲醇提取液蒸至近干后,残渣用氨试液溶解,转移至分液漏斗中,用水饱和的正丁醇萃取皂苷类成分,除去酚酸类酸性成分,所得的供试品溶液进样分析时被测成分分离良好,杂质不干扰测定。 
  目前测定三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量的方法多采用高效液相色谱法梯度洗脱[1-8],选用紫外检测器[1-5]、蒸发光检测器[6-8]进行测定。也有用超高效液相色谱法[9]测定其含量,但该法对仪器要求比较高,设备较昂贵,不易普及。本研究参考文献报道[1-5],在《中国药典》[10]方法的基础上针对本方进行了不同色谱柱、不同流速等条件的改良测定,建立了从供试品制备到样品检测的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量测定方法。结果证明该法具有样品处理简单、专属性强、灵敏度高,重复性好等特点,可以作为乳没活络散的质量控制方法。在乳没活络散稳定性试验中,除三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量测定外,还分对外观性状、鉴别、各项检查及微生物等指标进行了考察,结果均符合质量标准要求,说明本品在24 个月内质量稳定,直接接触药品的包装对药品质量无影响,故乳没活络散的有效期暂定为24 个月。 
  参考文献 
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