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焦磷酸测序鉴定建泽泻方法的建立

作者:www.jiaoshilw.com 更新时间:2018/10/12 13:29:03

泽泻为多年沼生泽泻科植物泽泻Alisma orientalis (Sam.)Juzep.的干燥块茎,最早历史记载可追溯到《神农本草经》。其性寒味甘,有泄热、利水渗湿、化浊降脂的功效[1],主要有利尿[2]、降血糖[3-5],降血脂[6-9]等活性。泽泻主产福建、四川、江西等地,素有“建泽泻”、“川泽泻”、“江泽泻”之称,以建泽泻、川泽泻量大且使用广泛,其中又以建泽泻质佳,被载入中国的道地药材。目前主要采用性状鉴别和化学成分分析对泽泻进行鉴定,该方法鉴定结果主观性较强,准确性无法得到保证。焦磷酸测序技术(Pyrosequencing) 是一种基于酶催化反应的新一代测序技术,其精确性和可重复性高,并能够实时、直观地提供序列信息,同时能定性定量分析差异碱基。该技术利用生物素标记一条扩增引物,扩增产物无需荧光标记与电泳分离,因此操作更为简便、快捷。本实验采收福建省建瓯建泽泻药材,同时以川泽泻作为对照药材(采自四川省眉山),采用焦磷酸测序方法鉴定其基源,为今后泽泻的质量控制研究奠定基础。 
  1 仪器与材料 
  1.1 儀器 PCR仪(美国Bio-Rad);高速离心机(德国eppendorf);生物安全柜(青岛海尔特种电器有限公司);超微量核酸/蛋白分析仪(英国Biochrom);数显恒温水浴锅(江南仪器厂);电泳仪(六一仪器厂);暗箱式紫外投射仪(上海顾村电光仪器厂);实时定量焦磷酸测序仪(凯杰生物工程有限公司);恒温孵育器(德国eppendorf)。 
  1.2 材料 建泽泻药材采自福建省建瓯吉阳镇,川泽泻药材采自四川省眉山市彭山区谢家镇,经福建省医学科学研究院徐榕青研究员鉴定为泽泻科植物泽泻。分别取建泽泻与川泽泻的须根、叶柄及叶片样本。 
  1.3 试剂 Binding Buffer、Denaturation Solution、Wash Buffer、annealing buffer、PyroMark Gold Q 24 Reagents均购自凯杰生物工程有限公司;2×EasyTaqPCRSuperMix(AS111-14)购自北京全式金生物技术有限公司;十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、乙二胺四乙酸(EDTA)购自美国BIOSHAPR;三羟甲基氨基甲烷、琼脂糖购自美国NOVON;其余试剂均为国产分析纯;实验引物由铂尚生物技术公司合成。 
  2 方法 
  2.1 DNA提取 采用的改良CTAB法分别提取建泽泻、川泽泻的须根、叶柄及叶片DNA。 
  2.2 PCR扩增 25μL PCR扩增体系中包含有1μL DNA模板(约50~100ng),12.5μL 2×Taq PCR MasterMix,10μmol/L上下游引物各1μL(引物序列见表1),用ddH2O补足至25μL。扩增条件为94℃-5min;(94℃-30s,58℃-30s,72℃-45s)×30 cycle;72℃-5min;扩增产物保存于4℃。 
  2.3 焦磷酸测序 取5μL PCR产物、1μL的beads、40μL bingding buffer,补足MQ至80μL,25℃1400rpm振荡孵育10min。经变性和洗涤后,使未标记生物素的DNA单链与已标记单链分离,将含有beading的反应板于80℃孵育2min后冷却至室温。试剂仓中加入所需的酶、底物和dNTP等进行检测。 2.4 测序验证 中药材DNA条形码鉴定系统中查询所得ITS2序列上游引物:5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′,下游:5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR扩增条件为94℃-5min;(94℃-30s,56℃-30s,72℃-45s)×30 cycle;72℃—10min;扩增产物于4℃保存。未经纯化的PCR产物送铂尚生物技术有限公司测序。 
  3 结果与分析 
  3.1 焦磷酸测序结果 采用焦磷酸测序技术进行SNP分析。根据ITS2位点突变情况,得两种峰图,建泽泻(含须根、叶柄、叶片)突变位点碱基为A(如图1所示),川泽泻(含须根、叶柄、叶片)突变位点碱基为T(如图2所示),二者突变频率均不小于83%(见表2)。 
  3.2 测序验证结果 测序序列与下载序列见表3,同时由图3可以看出,建泽泻ITS2序列与东方泽泻一致,与泽泻存在A-T突变;川泽泻ITS2序列与泽泻一致,与东方泽泻存在A-T突变。有研究表明东方泽泻与泽泻在ITS2序列上的A-T变异是稳定突变,因此可准确鉴定这两个物种[10]。故可判断建泽泻与东方泽泻基源一致,即Alisma orientalis (Sam.)Juzep. 
  4 讨论 
  实验采用焦磷酸测序技术对ITS2突变位点进行研究,发现建泽泻与川泽泻在突变位点碱基不同,且毛细管电泳测序技术进一步验证了这一结果,说明焦磷酸测序结果的准确性,因此本实验建立的基于ITS2突变位点的焦磷酸鉴定技术能准确鉴定不同产地的泽泻物种。与直接测序法相比,焦磷酸测序所用DNA不需要经过凝胶电泳纯化和荧光标记,测序过程中可对测序结果实时观察,同时能定性定量分析差异碱基,灵敏度高,操作便捷,适合已知序列的DNA短片段测序,是一种适用于中药材的分子生物学鉴定手段。 
  参考文献 
  [1]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:229.
  [2]Zhang X, Li X Y, Lin N, et al. Diuretic Activity of Compatible Triterpene Components of Alismatis Rhizoma[J]. Molecules, 2017, 22(9):1459. 
  [3]丁琛一, 谭擎英, 施宁川. 泽泻与格列齐特对原发性糖尿病大鼠治疗作用的评价[J]. 中国医学科学院学报, 2015, 37(4):451-455. 
  [4]Hsu P C, Tsai Y T, Lai J N, et al. Integrating Traditional Chinese Medicine Healthcare into Diabetes Care by Reducing the risk of Developing Kidney Failure among type 2 Diabetic Patients: a Population-Based Case Control Study[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2014, 156:358-364. 
  [5]许文, 罗奋熔, 赵万里, 等. 泽泻降糖活性提取物化学成分研究[J]. 中草药, 2014, 45(22):3238-3245. 
  [6]Miao H, Zhang L, Chen D Q, et al. Urinary biomarker and treatment mechanism of Rhizoma Alismatis on hyperlipidemia[J]. Biomedical Chromatography, 2017, 31(4):367-369. 
  [7]Li S, Jin S, Song C, et al. The metabolic change of serum lysophosphatidylcholines involved in the lipid lowering effect of triterpenes from Alismatis Rhizoma on high-fat diet induced hyperlipidemia mice[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2016(177):10-18. 
  [8]Jeong H S, Cho Y H, Kim K H, et al. Anti-lipoapoptotic effects of Alisma orientalis extract on non-esterified fatty acid-induced HepG 2 cells[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2016(16):239. 
  [9]Kim Y, Lee I S, Kim K H, et al. Metabolic Profiling of Liver Tissue in Diabetic Mice Treated with Artemisia Capillaris and Alisma Rhizome Using LC-MS and CE-MS[J]. The American Journal of Chinese Medicine, 2016, 44(8):1639-1661. 
  [10]马晓冲, 姚辉, 辛天怡, 等. 基于DNA条形码SNP鉴别东方泽泻、泽泻及市售泽泻药材[J]. 中国药学雜志, 2015, 50(17):1474-1478.